ترانسفکشن رده سلولی pc۱۲ بوسیله وکتور بیانی -nt۴ pegfpniو بررسی بیان پروتئینی آن

سابقه و هدف: یکی از تکنیک های پایه ای مهم برای مطالعه یک پروتئین اختصاصی در بیولوژی مولکولی، کلون کردن و بیان آن در سلول می باشد. از جمله روشهای منتقل کردن ژن، روشهای غیر ویروسی است که کم هزینه تر، آسانتر و ایمنتر می باشند. یکی از ژن های مهم که کاربردهای بالینی فراوانی دارد ژن nt4 است. این ژن یکی از اعضای خانواده نوروتروفیک است و در سلول های گلیال سیستم اعصاب محیطی و مرکزی بیان می شود. این نوروتروفین در بیان ژنی، بقا و تمایز رده های مختلف نورونی شرکت دارد. هدف از انجام این پژوهش، ساب کلونینگ و ترانسفکت این ژن به منظور مطالعه و دسترسی بیشتر با توجه به نیاز به این فاکتور نوروتروفیک در فعالیتهای ژن درمانی است. مواد و روشها: در این تحقیق، ژن nt4 با روش pcr در پلاسمید pcmv-sport6کلون گشته و پس از آن در باکتری اشرشیاکلی سوش dh5-α ترانسفورم شد. پلاسمید نوترکیب از باکتری میزبان استخراج و ژنnt4 با استفاده از آنزیم not i ,sal iاز پلاسمید جدا گردید. در مرحله بعد پلاسمید برای پذیرش قطعه nt4 و انجام کلونینگ با آنزیم hind iii برش داده شد و ژن nt4 درون پلاسمید pegfp-ni ساب کلون شد. محصول واکنش اتصال در باکتری فوق ترانسفورم و در محیط lb حاوی آمپی سیلین کشت داده شد. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از کیت استخراج پلاسمید، از باکتری تخلیص و در مرحله بعد در سلول pc12 ترانسفکت گردید و در خاتمه بیان پلاسمید نوترکیبب با روشsds page ,western blotting مورد بررسی قرار گرفت. یافته ها: آنالیز آنزیمی و تعیین توالی نشان داد پلاسمید ژن مورد نظر حاوی توالی صحیحی بوده و تطابق کامل با توالی ژن مورد نظر در بانک ژن دارد. در آنالیز پروتئین های جدا شده از سلول های ترانسفکت شده با روش sds-page، باندی حدود 45 کیلودالتون مشاهده شد که با آنتی بادی مونوکلونال در آنالیز وسترن بلات مورد تأیید قرار گرفت. نتیجه گیری: این پلاسمید به دلیل ساختار صحیح، جهت انتقال به سیستم یوکاریوتی و ارزیابی بیان مناسب می باشد.